看你准备用什么系统来做敲除了。原则上，不同系统对于同源臂长度要求不同，根据这个来设计引物。做敲除一般启动子等元件无需考虑
方法非常多，列举一两个：
不同的粘性末端不能相连。所以，如果要相连，就要去除不同的粘性末端，进行平末端相连。
粘末端变成平末端有两种方法：klenow酶的补平或者s1核酸酶的切平。
为了减少载体自连，可以用碱性磷酸酶处理载体。
最后将载体和目的基因链接，构建重组质粒。
设计引物，自带酶切位点，扩增目的基因，直接改变目的基因的酶切位点，然后再用和载体相同的限制酶酶切目的基因，切出相同的粘性末端。